泛实体瘤MRD | 迈杰医学自研实体瘤微小残留病灶检测方案-迈杰转化医学

泛实体瘤MRD | 迈杰医学自研实体瘤微小残留病灶检测方案

来源：时间：2023-05-18

MRD即微小残留病灶（Minimal Residual Disease），是指在患者接受治疗期间或之后，其体内仍有少量肿瘤细胞或者微小病灶的临床状态，也叫分子残留病变（Molecular Residual Disease）， MRD 阳性意味着癌症治疗后血液中可检测到来自肿瘤的DNA（发现癌细胞，癌症治疗后残留的癌细胞会变得活跃并开始繁殖，导致疾病复发） ；阴性结果表示癌症治疗后未检测到残留（剩余）病灶。许多研究都表明，如果MRD无法自行代谢或者被机体的免疫机制清除，反而持续增长，患者有极大概率在根治术后肿瘤复发。目前，全球有多项观察性临床研究的数据验证了在多个泛实体瘤癌种中，接受了根治性治疗的MRD阳性患者，复发概率远高于MRD阴性患者，如果执行辅助化疗后，患者的MRD状态仍为阳性，则属于复发的高风险人群。

临床上，MRD监测最早通过流式细胞术应用于白血病或者淋巴瘤的肿瘤细胞残留监测。近年来，国内外正不断尝试将MRD检测应用在实体瘤中，MRD动态监测贯穿于肿瘤精准诊疗的全过程，其主要应用场景分为辅助治疗决策、预后评估、术后复发监测、免疫治疗疗效监测、临床试验替代终点、基于新辅助治疗反应的手术决策以及临床试验受试者入组筛选。基于ctDNA指导的MRD，优于传统的临床或影像学方法鉴定出有MRD的患者，这是因为游离肿瘤核酸（ctDNA）和预后有着较强的相关性，特别是ctDNA MRD技术在实体瘤转移性复发患者的早期治疗干预中起很重要作用^[1-3]。国外研究表明，在不同的癌种中，MRD能够比传统的CT影像学更早鉴定出疾病复发风险具体的提前时间约为：乳腺癌10.7个月 ^[4] ，胰腺癌6.5个月 ^[5] ，肺癌5.2个月 ^[6] ，结肠癌11.5个月 ^[7] 。

MRD最新临床研究结果

MRD已在多种肿瘤中证实了预后及提前预测复发的潜力，最新的研究已拓展到更多的小癌种，并对MRD检测窗口期进行了探索。

2023年ASCO会议公布了一项回顾性研究，该研究纳入了两个机构自2021年以来接受dCRT的31例肛门鳞癌（ASCC）患者，患者中位年龄为61岁，65%的患者为III期肿瘤，并在患者提供书面知情同意的情况下进行了ctDNA检测。研究者通过指检、内镜检查和/或MRI的无肿瘤结果定义患者的cCR状态，并根据cCR、肿瘤复发和生存情况进行患者的ctDNA缓解情况评估。共有27例患者成功接受了基线ctDNA检测，其中23例可检出基线ctDNA，检测阳性率为85%。与I-II期患者相比，III期患者的基线ctDNA水平更高（34 MTM/ml vs 3.2 MTM/ml，p=0.0310），如下图所示。

图1. I/ll/III期患者ctDNA基线水平

在治疗中期进行的检测显示，共有57%的患者在21天内实现ctDNA转阴，对不同期别患者进行的分层分析显示，73%的I/II期患者在30天内实现ctDNA转阴，50%的III期患者在31天内实现ctDNA转阴。

在治疗结束后，因1例患者的组织不足无法进行评估，96%的患者ctDNA为阴性，除1例患者外，其他患者的ctDNA均于治疗结束后1周内确认为阴性。生存分析显示，所有患者的1年无病生存（DFS）率为96%，1年总生存（OS）率为100%，患者的ctDNA缓解时间明显短于cCR时间（中位30天 vs中位136天）。

对于ASCC患者，ctDNA技术具有较高的基线可检测率和较低的技术失败率，且其疗效评估速度显著优于常规临床评估。结合既往研究的数据，研究者认为相较于标准临床评估，ctDNA技术在患者的疗效评估方面应用前景可观。由于该试验为回顾性分析，因此需要后续的前瞻性研究进一步明确这一结论。

另一项胃食管癌MRD监测研究纳入了来自11个机构的45例完成了新辅助治疗并在治疗性手术时有TRG0或TRG1评分的I-III期胃食管癌患者，对手术后的16周分子残留病 (MRD) 窗口内、随访期内的250例血浆样本进行ctDNA分析， 主要研究终点是无复发生存期 (RFS)。

在术后16周MRD窗口期患者 (N=21) 中，与ctDNA阴性的患者 (复发率：11.1%，2/18) 相比，ctDNA阳性的患者更高的复发率 (复发率：66.7%，2/3)，ctDNA阳性的患者与无复发生存期 (RFS) 显著缩短相关 (HR 23.0, 95% CI 2.0-268.1p=0.012)。

中位随访时间22.3个月，对36例患者术后任一时间的ctDNA状态分析：10例ctDNA阳性患者中7例患者复发，2例患者在治疗过程中得到治疗响应，临床结果转为阴性，ctDNA持续阴性患者26例，仅有2例患者复发。术后任一时间ctDNA阳性患者的PFS进一步缩短 (HR39.7;95% CI 4.7-332.4;p<0.0001)。

在临床病理显示良好的亚组患者中， 术后ctDNA检测也可识别高复发风险患者 。在更大型的队列研究中， ctDNA可进一步细化新辅助治疗后的风险分层，对指导辅助治疗有潜在作用。

检测路线：Tumor-informed和Tumor-agnostic各有特色

肿瘤组织先验分析（Tumor-informed assays）需要对肿瘤组织进行WES+个性化panel的检测。肿瘤组织先验（Tumor-informed）策略首先需要对患者的肿瘤组织进行高通量测序（以WES为主），确定每位患者的肿瘤特异突变，并且选择一定数量的高丰度的躯干突变定制个性化panel（通常包括16~50个肿瘤特异突变），最后在患者血浆ctDNA中检测这些突变，以达到监测MRD的目的。

肿瘤组织先验分析策略因检测突变靶点少，大幅降低了由于技术和生物背景（比如克隆性造血）导致的假阳性风险，也因此可以进行极高深度的测序，提高检测的灵敏度。但由于是对特定位点进行监测，很难克服肿瘤克隆演化导致的假阴性结果。

肿瘤组织未知分析（Tumor-agnostic assays）不需要获取肿瘤组织，直接对血液进行MRD检测。肿瘤组织未知（Tumor-agnostic )策略主流是用一个普适性、一般有三四百个基因甚至更多基因的大panel进行检测，相当于固定化panel的检测。采用固定的panel，无须预先获取患者肿瘤组织进行测序，可以大幅简化流程、降低成本及缩短患者MRD状态评估周期。然而，tumor-agnostic assay对固定化panel的设计要求更高。在2021年ASCO会议的一项临床研究显示，分析接受根治手术的400例结直肠癌患者的ctDNA MRD状态研究可知，分布在4425个基因的6400个突变位点中，每位患者独有基因占75%，只有2位患者出现共有基因占17%，3位及以上患者共有基因≤5%。因此，如何设计固定化panel，能够对不同患者都有一定数目的突变覆盖，并且采用经广泛验证的算法分析从而用于MRD检测，是tumor-agnostic assay需要重点克服的难点。两种策略的优劣势如下表1所示：

表1. 两种检测路线优劣势对比

迈杰医学泛实体瘤MRD检测产品

目前迈杰医学自主开发了基于tumor-informed策略的泛实体瘤MRD检测产品,本产品的肿瘤组织检测体系WES-Plus为19800余个基因全部外显子和部分内含子区域，并对与肿瘤发生发展密切相关的601个基因进行了加密。鉴定出患者的变异图谱后，针对每个患者挑选20个突变位点进行个性化panel定制，定制panel经生产及质控合格后，对患者血浆cfDMA样本进行超高深度测序（≥100000×），进而用于血浆中痕量的ctDNA MRD监测，检测流程如下图所示。

图2. 迈杰医学MRD检测技术路线图

产品性能

本产品验证采用了5例MRD标准品（平均突变频率从0.005%～0.125%)及30例健康人血浆样本分别以30ng投入量，使用多重扩增流程分别进行建库并上机测序，其中标准品为3重复，单位点测序深度超100000×，分析上述标准品结果及相应位点在健康人血浆中的检出情况来验证检测灵敏度及特异性情况。

图3. 标准品位点的检出情况（*标记为检出）

在位点层面（site level）对于不同突变频率水平的位点，随着突变频率的降低，检出灵敏度也相应降低，总体位点特异性为98.3%。以≥95%检出作为最低检测限LoD判断标准，汇总分析所有位点检出情况可得，迈杰医学MRD监测体系单点水平LoD可达0.03%。

在样本层面（sample level），以≥2 SNV变异检出为MRD阳性判断值，0.005%～0.125%水平样本层面的灵敏度及特异性均为100%，即样本层面MRD检测LoD可低至0.005%（十万分之五）。

迈杰医学自行研发的泛实体瘤MRD产品已全面上线，产品检测panel覆盖面广泛，支持多种实体瘤MRD检测，目前在肺癌、结直肠癌、肝癌及食管鳞癌中已有丰富项目经验。

参考文献

[1] Reinert T , Henriksen T V , Christensen E , et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J]. JAMA Oncology, 2019, 5(8).

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[7] Reinert T , Henriksen T V , Christensen E , et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J]. JAMA Oncology, 2019, 5(8).

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