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迈杰转化医学研究(苏州)有限公司

技术进展
杰论系列 | 流式细胞检测在受体占位中的应用
来源: 时间:2024-01-26
背景

流式细胞术广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面,用于基于细胞层面不同亚群生物指标、分化状态、活化、增殖经历过程。免疫疗法的重点是通过抗体与不同免疫细胞亚群上的受体结合,并根据所其产生的激活或抑制功能现 象调整临床免疫反应策略。受体占位生物分析常用的检测技术为流式细胞技术。在免疫疗法中,RO作为药效学(PD)的生物指标,与药代动力学(PK)相结合,指导临床治疗应用。


受体占位检测的意义

受体占位检测,顾名思义是药物对细胞 表面靶受体占有情况的检测。在抗体药物对细胞靶向治疗的过程中,受体占位是一种重要的药效动力学生物指标。 R O 占有过低,可能会起不到治疗效果;而如果长期 RO 占有过饱和状态,会有过度结合,导致一定的副作用或者毒性。

受体占位在细胞靶向治疗生物药临床研究各个阶段都具有重要作用。

  • 在临床I期,受体占位有助于药物从动物到人的靶点确证,考虑种属差异,受体表达丰度差异等因素,通常临床试验受体占位检测方法需要重新优化。

  • 临床II期,受体占位确证药物浓度、受体结合、免疫原性抗药抗体( ADA) 和药效的关系。帮助确定临床有效剂量,指导决策。

  • 临床III期,受体占位辅助确定抗体药物的群体PK特征。确定年龄、性别、体质量等协变量是否对生物药作用机制有影响。上市后,受体占位用于开发新适应症或下一代治疗剂的比较。特别是在早期临床,受体占位有助于建立基于最小生物学效应水平MABLE 的临床前到临床的准确首次人体剂量优化模型 [1]


RO的检测方式及检测原理

受体占位检测有三种不同的形式: 自由检测法,药物占据直接检测法和总受体检测法 [2]
  • 自由检测法Free Receptor Assay
    通过带有荧光信号的与药物竞争性的抗体占有未被生物治疗药物占用的受体来间接评价确定结合的受体(如图1)。有时也称为竞争法,竞争性抗体是结合与生物治疗剂相同或相似表位的抗体,这意味着它将结合未被生物治疗剂占用的自由受体。治疗性抗体,然后用同一抗体药物进行标记后染色,它只会与剩余的游离受体结合。
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图1:自由检测法原理


  •  药物占据直接检测法 Bound Receptor Assay):
    这是一种直接测定RO的检测方法,用荧光标记的特异性抗体与目标受体结合的生物治疗剂相结合是最常用的(如图2)。 对于该分析,评估结合的特 异性以及用于确定背景荧光的抗独特型的最佳浓度至关重要 ,合适的浓度可以降低测量背景,放大拷贝数受体特异性的检测信号
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图2:药物占据检测法原理


  • 总受体检测法Total Receptor Assay):
    它允许测量细胞表面的总受体。测量总受体的方法可用非竞争性抗体法和饱和药物法(如图3)。非竞争性抗体是一种荧光标记抗体,它与受体上的表位结合,与生物治疗剂识别的表位不同。饱和药物法是用饱和浓度的生物治疗药物预先孵育细胞,然后使用荧光标记的特型抗体检测生物治疗药物。用标记的生物治疗药物对处理后(剂量后)样品进行测试以检测游离受体。剂量前的总量用于所有剂量后的时间点,以计算受体占用(RO)。

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图3:总受体检测法原理


如何选择ROA(RO Assay)检测模式

那哪种模式对于RO的检测会更好呢? 我们认为针对于不同的生物治疗药物, 针对不同的靶点受体的选择,从样本、试剂等多个维度对 RO 分析的设计、优化、验证及检测。

ROA(RO Assay)设计之前考虑的因素:

在深入研究ROA的设计之前,了解生物治疗药物及其作用机制背后的生物学是至关重要的 [3] 。预先确定可用的试剂,可以确定三种方法中哪一种更适合具体的研究,这一点也很重要。对潜在治疗靶点的评估,例如靶点受体的表达水平及丰度、以及随着给药过程的进行,靶点受体的变化等因素,检测试剂的荧光信号背景、试剂的亲和力、稳定性及关键试剂的制备等因素,也都会影响检测方法的选择及确定(如表1)

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表1:ROA考虑因素

哪种模式对于RO的检测会更好呢?
(1)对于自由检测方 法(Free Receptor Assay),应用场景较高的是对于市场成熟度比较高的竞争性抗体的靶 点, 或者用可荧光素/生物素标记化的生物治疗药物。 荧光素标记蛋白抗体、生物素标记蛋白抗体已经成为实验室的常规操作,在实验室中的可实行度较高。
(2 药物占据直接检测方法(Bound Receptor Assay),如果生物治疗性药物为单克隆抗体,可以使用其相应的二抗进行检测方法建立。该种方法的优点是可以放大低拷贝数受体的特异性型号检测值。 合理的优化抗体浓度,会降低抗体特异性的背景值。
(3 总受体检测法Total Receptor Assay)需要用生物治疗性药物进行稳定性较高,成熟度较高的非竞争性抗体的筛选。 但该检测方法能够实时获得在不同剂量,不同时间的给药过程中总受体的与结合药物受体之间的关系。
RO数据可以在药物计划的成熟和治疗过程中为药物-靶标关系行为提供更多信息。受体占用率比任何成分测量都能更好地评估PD临床试验的ROA。遵循适合流式细胞术方法的特定目的验证。



参考文献

[ 1 ]  中国临床药理学与治疗学 , 2020 Jan; 25

[2] Alessandra Audia, Gregory Bannish, Rachel Bunting and Chelsea Riveley (2022). Flow cytometry and receptor occupancy in immune-oncology. Expert opinion on Biological therapy. Vol.22, NO,1, 87-94.

[3] Jennifer J.Stewart, Cherie I.Green, Nicholas Jones, Yuanxin Xu, et al.(2016). Role of Receptor Occupancy Assays by Flow Cytometry in Drug Development. Cytometry B: (Clinical Cytometry) 90B:110-116.

本文标签: 药物临床前服务 药物临床前研发服务 靶向药伴随诊断 核酸检测多少钱 生物标志物分析