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什么是AAV（腺相关病毒）

近年来腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体逐渐发展为基因治疗领域的热门递送平台，野生型 AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组，需要依赖腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。临床应用中使用不需要辅助病毒的重组 AAV 病毒（rAAV）将目的基因的 CDS 区序列插入 rAAV 表达质粒中，包装病毒，然后直接使用 rAAV 感染细胞就能完成目的基因操作。 作为一种基因导入系统，AAV病毒载体具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞、能介导基因的长期稳定表达等优点，因此在神经系统、眼科和代谢类疾病的研究中，受到越来越多的关注和重视。

图1. AAV载体递送机制（注：图源网络）

rAAV的优点

• 安全性高

目前未有AAV对人体致病的报道，每10个人中就有8个人在一生中会感染AAV。

• 免疫原性低

当AAV用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时，很少有受感染的细胞被免疫系统所清除。

• 感染谱广

几乎所有处于分裂期和静止期的细胞都可以使用 AAV 来感染。

• 表达时间长

rAAV可在宿主细胞中形成附加体存在于细胞核中，在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达 5个月以上。

• 扩散性强

rAAV具有远高于腺病毒和慢病毒的扩散性，可以穿透血脑屏障。

• 高稳定性

rAAV病毒可在2-8℃下长期保存。

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AAV基因治疗产品国内外研发进展

腺相关病毒(AAV)最早于1965年首次在实验室的腺病毒制剂中被发现。在后续的十多年里，科学家们主要将研究方向集中在AAV的基因结构与组成、DNA的复制与转录、感染的潜伏性以及病毒粒子的组装等方面，并于1982年成功完成了AAV2基因组的克隆以及测序工作，AAV的神秘面纱逐渐被揭开。这些早期研究为AAV作为基因递送载体而被广泛使用提供了坚实的理论基础。

AAV载体于1995年首次用于治疗人类的囊性纤维化病，步入21世纪后越来越多的AAV血清型家族被发现，这极大的丰富了体内基因递送的AAV载体工具箱。2008年基于AAV载体的基因疗法在治疗莱伯氏先天性黑蒙症的疗效方面取得了令人信服的证据。2012年首个基于AAV的基因治疗药物Glybera获得了欧洲药品管理局EMA的批准，5年后Luxturna成为首个获得美国食品药品管理局FDA批准的用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病的AAV基因治疗产品。

图2. AAV发展史（注：图源网络）

截止到目前，全球范围内已上市的AAV基因治疗产品共有5款（表1），极大地推进了该领域的发展。

表1. 目前获批的AAV基因治疗产品

以AAV检索http://Clinicaltrials.gov数据库，全球共有200多项AAV递送蛋白质基因相关的研究项目，适应症多为血液疾病、眼部疾病和神经系统疾病。

国内该领域大部分产品处于临床前阶段及早期临床阶段。 国内眼科基因治疗头部企业纽福斯的NR082眼用注射液在中国已经完成一期、二期临床试验，正在开展三期临床；信念医药BBM-H901、天泽云泰VGB-R04等产品均已进入临床试验阶段，康弘药业、北海康成等众多企业也分别布局了AAV基因疗法， 整体而言已经呈现“百家争鸣”的大趋势 。

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AAV的免疫原性研究

AAV相对于其它病毒载体有较好的安全性，但非预期的免疫反应依然是AAV药物开发需要关注的重点。针对AAV的免疫反应既可能是体内预先存在的中和抗体，又可能是AAV激活固有免疫产生急性毒性，又或者是产生针对AAV或其蛋白产物的适应性细胞免疫或体液免疫。

图3. AAV的免疫反应（注：图源网络）(i)、(ii)预先存在的中和抗体可以与A AV衣壳结合，分别阻止AAV进入细胞甚至进入细胞核， (iii)基于TLR2、TLR9的对病毒衣壳或任何释放的基因组物质的固有免疫反应， (iv) MHC I类肽识别后CD8+ T细胞的细胞毒性反应， (v) 针对转基因产物的体液免疫反应。

1. 抗AAV总抗体检测

AAV载体的基因治疗药物的免疫原性主要考虑3个方面：载体的免疫原性评估，核酸的免疫原性评估及蛋白表达产物的免疫原性评估。

以载体的免疫原性评估为例，抗载体衣壳蛋白的ADA，可采用常规基于ELISA或MSD平台的间接法或桥连法进行评估（如图4），在此不再赘述。

图4. AAV载体的免疫原性评估（注： 图源网络）

2. 抗AAV中和抗体检测

针对与wtAAV的衣壳相同或相似的rAAV衣壳。由于天然wtAAV感染，在大部分人群血液循环中有预存的NAb，并且它会有效地阻断rAAV基因转导，导致药物无法发挥药理学活性。因此，存在抗AAV中和抗体阳性的患者无法接受相应治疗，NAb筛查和排除血清反应阳性受试者是相应临床研究中的必要步骤。

表2. 人体中常见不同血清型AAV的预存抗体比例（注：图源网络）

3. 基于细胞的抗AAV中和抗体试验的主要设计原理

首先构建一个和基因药物有相同衣壳蛋白的腺相关病毒，AAV-GFP，该病毒能自主表达绿色荧光蛋白。使用AAV-GFP感染细胞，通过检测荧光信号来评判感染的效果。在AAV-GFP感染细胞之前，将其与血清样本进行预先孵育，血清样本中的抗AAV中和抗体能够阻断AAV-GFP感染细胞，导致荧光信号的衰减，从而评价血清中抗AAV中和抗体的效果。该方法可用于中和抗体的预筛及给药后的中和抗体的检测。

图5. 抗AAV中和抗体检测原理（注：图源相关公司公众号）

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行业共识

AAV载体基因疗法中，NAb的存在与较差的治疗疗效相关，因此检测中的阳性有时被用作临床试验的排除标准，同时，由AAV诱导的Nab又限制了相同血清型衣壳的再给药。因此，准确检测可能抑制病毒衣壳转染靶细胞能力的抗体（也称为NAb或转导抑制试验），显得尤为重要。

一般LBA方法用于检测抗AAV总抗体，细胞法用于检测抗AAV中和抗体。

常规的桥接法检测ADA/NAb，比基于细胞的方法拥有更好的灵敏度和特异性，但是由于转导抑制过程的复杂性，此方法的科学性需要进行论证。

对于商业化产品，ADA/NAb检测可被认为是CDx，并应在美国CLIA认证的实验室进行。在中国，通常需要ISO 13485和GMP认证。

当考虑使用抗衣壳抗体检测(ADA和NAb)时，需要评估的几点原则：

• 了解抗衣壳抗体的存在对临床结果的影响

• 排除标准需要科学和临床证明

• 在不了解对安全性和有效性的影响的情况下，不应普遍使用抗衣壳抗体检测来排除患者

• 对于首次人体研究，建议采用预防原则，这些研究可能需要从基于AAV的GTx试验中排除ADA/NAb阳性受试者

• 如果ADA/NAb阳性受试者被排除在关键研究之外，应考虑对这些受试者进行单独的研究

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AAV载体基因疗法发展展望

尽管基于AAV载体的基因治疗产品在临床上取得了令人鼓舞的结果，但这种新型的体内基因递送平台还存在很大的局限性与挑战性，较小的基因组和中和抗体限制了其在许多疾病中的应用。

在全球利好和资本青睐的趋势下，基因疗法将有更深远的发展。作为基因疗法中广泛使用的AAV载体，其工程化以及搭载双抗在眼科、CAR-T疗法的替代等领域，都具有极富潜力的应用前景。本司拥有AAV载体基因治疗药物免疫原性研究相关的检测平台和丰富经验，期待更多的技术交流和合作。

参考资料：

1. Corsaro B, Yang T, Murphy R, et al. 2020 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis: Vaccine Assay Validation, qPCR Assay Validation, QC for CAR-T Flow Cytometry, NAb Assay Harmonization and ELISpot Validation (Part 3–Recommendations on Immunogenicity Assay Strategies, NAb Assays, Biosimilars and FDA/EMA Immunogenicity Guidance/Guideline, Gene & Cell Therapy and Vaccine Assays)[J]. Bioanalysis, 2021, 13(6): 415-463.